ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ПРОЦЕССА ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ПРОЦЕССА ФОТОРЕАКТИВАЦИИ (ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ) ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МУЛЬТИВОЛНОВЫХ УФ ЛАМП И ЛАМП СРЕДНЕГО ДАВЛЕНИЯ ФИРМЫ BERSON

Доктор Бен Ф. Калисваарт (Ben F. Kalisvaart), микробиолог

Ультрафиолетовое (УФ) излучение – широко применяемая технология для дезинфекции питьевых, промышленных и сточных вод (альтернатива хлорированию). Разработанные УФ лампы излучают дополнительные электромагнитные волны в спектре бактерицидного УФ излучения, что препятствует восстановлению микроорганизмов. Для снижения вероятности восстановления микроорганизмов после УФ облучения необходимо разрушить как можно больше их составляющих. Благодаря мощному энергетическому выходу УФ излучения на специфических волнах определенной длины достигается высокая эффективность полихроматических УФ ламп среднего давления в дезактивации микроорганизмов. Именно сочетание этих свойств обеспечивает гибель больших и малых микроорганизмов. Кроме ДНК разрушаются и другие важные биологические молекулы и это не позволяет облученному микроорганизму восстановиться. В последних исследованиях биологического влияния волн длиной больше и меньше 254 нм на такие микроорганизмы, как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Cryptosporidium parvum, доказана их эффективность. При сравнении при одинаковой дозе УФ излучения ламп низкого и среднего давления отмечены преимущества полихроматических УФ ламп, без формирования побочных продуктов дезинфекции. Результаты исследований показывают, что такие микроорганизмы, как E. Coli, свободно восстанавливаются после воздействия УФ излучения ламп низкого давления, эффект фотореактивации после облучения УФ лампами среднего давления не обнаружен.

Уже с конца девятнадцатого века монохроматическое УФ излучение было известно как эффективный метод для уничтожения микроорганизмов. Также было известно, что ферментативные процессы восстановления позволяют микроорганизму избавиться от разрушений, нанесенных УФ лампами низкого давления.

Компания Berson UV-Techniek более 25 лет назад была первой, кто разработал второе поколение УФ ламп, известных как лампы среднего давления. Эти лампы излучают волны более широкого спектра УФ излучения, что позволяет разрушать не только ДНК, но и другие биологические молекулы. Сегодня лампы этого типа широко применяют для дезинфекции питьевых, сточных и промышленных вод. В конце ХХ в. были разработаны усовершенствованные УФ лампы среднего давления. Они имеют такой же высокий КПД, как и лампы низкого давления, при значительно более высоком бактерицидном эффекте.

УФ дезинфекция

Одним из первых упоминаний, касающихся бактерицидного эффекта УФ излучения, был доклад ученых Даунса и Блаунта (1877 г). Они описали летальный эффект солнечного света в отношении смешанной микробиологической популяции и отнесли этот эффект за счет УФ излучения.

Впервые на практие УФ излучение было применено при обработке питьевой воды. Сегодня с помощью УФ излучения обеззараживают сточные и промышленные воды, сахарные и солевые растворы, крахмальные растворы и ультрачистую воду.

УФ излучение доказало свою состоятельность как очень “чистая” альтернатива реагентным процессам дезинфекции таким, как хлорирование, применение хлор диоксида или озона, так как при УФ излучении не образуются нежелательные побочные компоненты. Даже образование тригалометанов может быть снижено, если хлорирование (первичное или вторичное) будет заменено УФ дезинфекцией. УФ излучение не влияет на вкус, запах или цветность воды.

Спектр излучения УФ ламп

Поскольку спектр УФ излучения и его интенсивность играют важную роль в процессе деактивации микроорганизмов, в новых УФ лампах среднего давления эти важные свойства объединены. Улучшенные характеристики этого типа УФ ламп, способствующие множественному повреждению микроорганизмов, достигаются следующими факторами:

• широкий спектр УФ излучения
• высокая интенсивность УФ излучения
• улучшенная УФ эффективность (КПД).

Электромагнитный спектр УФ излучения

В электромагнитном спектре существует участок, включающий волны длиной от 100 до 400 нм. Эти волны называют УФ излучением. Участок можно грубо разделить на три части (Jagger, 1967):

• вакуумное УФ излучение: 100 -190 нм
• УФ – С и УФ – В: 190 – 300 нм
• УФ – А: 300 – 400 нм

Поскольку вода и воздух абсорбируют все волны длиной менее 190 нм (вакуумное УФ излучение), только волны длиной от 190 до 380 нм могут быть использованы как обладающие микробиологическим эффектом (Harm,1980).

Абсорбция УФ излучения

УФ лампы излучают в УФ участке спектра при следующей длине волн:

• монохроматические УФ лампы низкого давления – 254 нм
• полихроматические УФ лампы среднего давления – 185 – 400 нм
• мультиволновые полихроматические УФ лампы – 185-400нм Фотоны излучаются на каждой специфической длине волны. Каждый фотон содержит определенное количество энергии, которое зависит от длины волны. Когда фотон поглощается материей, например, микроорганизмом, электроны в атоме или молекуле, составляющей вещество, переходят в возбужденное состояние.

Чем больше и сложнее молекула (например ДНК или протеины), тем больше волн разной длины она поглощает, тем шире линия спектра поглощения. Атомы держатся вместе на связях в виде общих электронов, распределенных между ними. Когда поглощаемая энергия с фотонов достигает порогового уровня (энергия ионизации), эти связи могут быть разрушены. При этом молекула разделяется на две части или более. Такая фотохимическая реакция называется диссоциацией. Очевидно, только энергия фотонов, абсорбирующаяся веществом, может быть фотохимически эффективной (принцип Драпера-Гротхуса).

Поглощение УФ излучения ДНК

Длина волн УФ излучения, необходимая для достижения биологического эффекта, находится в диапазоне от 190 до 380 нм. Большинство биологических повреждений, особенно в очень маленьких микроорганизмах протекают, прежде всего, за счет фотохимических реакций в нуклеиновой кислоте ДНК, которая содержит генетический материал всех клеточных организмов.

Кривая поглощения (Von Sonntag, 1986) показывает максимум на длине волны 200 нм. Также существует пик поглощения в интервале 260-265 нм. Поэтому максимум поглощения не происходит при длине волны 254 нм, которую ошибочно считают наиболее эффективной для уничтожения микроорганизмов.

Основные составляющие молекулы ДНК (рибоза и фосфаты) не поглощают волны длиной более 210 нм. Поглощение волн длиной более 210 нм происходит за счет нуклеотидной основы: аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил (в случае РНК). Результатом поглощения фотонов нуклеиновой базой является образование фотопродуктов.

Поглощение УФ излучения белками и ферментами

Кроме ДНК и РНК, фотохимические процессы могут происходить в белках, ферментах и других биологических молекулах. Особенно этот процесс выражен для крупных микроорганизмов размерами от 10 до сотен мкм. УФ излучение не может проникнуть глубоко в эти микроорганизмы и не разрушает ДНК.

Спектр поглощения для белков указывает, что максимальный пик располагается в зоне 280 нм. В дополнение к этому пептидные связи (-СОNH-) в протеинах показывают характеристики удвоенных связей.

Доказано, что при поглощении УФ излучения аминокислотами протеины и ферменты становятся неустойчивыми. Если достигается диссоциативная энергия для дисульфидной связи (Б-Б), изменяет­ся третичная структура амино­кислоты, что, в свою очередь, приводит к изменениям (денатурации) биомолекулы. Молекула теряет биологическую активность и способность к делению. Так как концентрация протеинов в микроорганизмах очень высокая (50% сухой массы), то поглощение УФ излучения влияет на их роль в синтезе нуклеиновой кислоты и хромосомной структуре (Ingraham 1994).

Поглощение УФ излучения другими биомолекулами

Кроме ДНК, протеинов и ферментов, существуют другие биологические субстанции с ненасыщенными связями, которые дезактивируются УФ излучением, в частности, коэнзимы, гормоны, носители электронов.

Биомолекулы, абсорбирующие УФ-С и УФ-В (длина волны менее 300 нм)

Еще в 1967 г. Джаггер заявил, что основными абсорбентами УФ излучения являются вещества, вовлекающие сопряженные связи (единичные и двоичные). Структуры, которые содержат сопряженные кольца, являются хорошими абсорбентами УФ излучения с длиной волны менее 300 нм. Абсорбция такого излучения ароматическими кислотами приводит к разрушению структуры кольца.

Вот некоторые биомолекулы -абсорбенты УФ излучения с длиной волны менее 300 нм:

• шестизвенные еричные углеродные кольца: бензол, толуол, фенол
• азотсодержащие кольца: пиридин, имидазол, пиримидин, цитозин, тимин, урасил
• двоичные кольца: нафталин, пурин, аденин, гуанин
• троичные кольца: антрацин, рибофлавин
• четвертичные кольца: стероиды, порфирины
• аминокислоты: триптофан, тирозин, фенилаланин, цистеин
• другие биомолекулы: никотинамид аденин динуклеотид.

Биомолекулы, абсорбирующие УФ излучение с длиной волны более 300 нм

К этим биомолекулам относятся:

• троичные кольца: рибофлавин
• четвертичные кольца: порфирины, стероиды
• длинноцепочечные сопряженные молекулы: каротиноиды.

Бактериологический эффект видимого излучения

Еще в 1893 г. Ворд описал способность солнечного спектра волн длиной более 300 нм убивать небольшие бактерии (диаметром менее 10 нм). Однако поврежденные биологические молекулы еще не были идентифицированы. Поскольку протеинам и нуклеокислотам свойственна небольшая способность абсорбировать УФ излучение длиной волны более 340 нм, возможно воздействие на другие абсорбирующие биомолекулы, разрушение которых приводит к уничтожению небольших микроорганизмов.

В 1952 г. было установлено, что при длине волны более 300 нм и близкой к видимому спектру нарушается способность микроорганизмов к размножению.

Предполагали, что микроорганизмы уничтожаются при длине волны более 300 нм, так как повреждения, причиненные такими волнами, сложнее восстанавли­ваются, чем нарушения, причи­ненные волнами длиной 254 нм. Это предполагает, что как и пиримидиновые димеры, солнечное излучение обусловливает летальные повреждения, которые не восстанавливаются. Такие повреждения не возникают при использовании излучения УФ ламп низкого давления с длиной волны 254 нм и, наоборот, возможны, при использовании УФ ламп третьего поколения с мультиволновым спектром.

Экспериментально было показано, что при отфильтровывании волн длиной менее 360 нм, то есть используя выше лежащий спектр волн, можно достичь необратимого повреждения клеток и их гибели. Бактерицидный эффект солнечного излучения почти целиком обусловлен образованием кислородных радикалов в цитоплазме (Tortora, 1995).

Эксперимент с солнечным светом свидетельствует, что, воздействуя на разные биомолекулы (не только ДНК и протеины), можно добиться необратимого повреждения микробной клетки.

Волны, не входящие в спектр УФ-С излучения, могут играть даже более важную роль в уничтожении больших, а, соответственно, более устойчивых к УФ излучению микроорганизмов (Cryptosporidium parvum), так как большие клетки менее проницаемы для УФ-С. Проникновение в большие клетки волн длиной менее 295 нм является основной проблемой при их уничтожении, и это увеличивает значение других волн. Абсорбция органическими молекулами внешней клеточной мембраны играет важную роль в уничтожении крупных микроорганизмов.

Восстановление повреждений от УФ излучения

Способность к восстановлению повреждений после УФ излучения является обычным процессом для всех организмов. Этот процесс называется реактивацией и, соответственно, описан как темновая реактивация и фотореактивация (Schlegel, 1992). Условия достижения реактивации могут значительно варьировать в зависимости от уровня биологической организации организма и типа УФ повреждения.

Механизм восстановления микроорганизмов не является универсальным, не существует точно определенных характерис­тик для определения, какие суб­станции способны к восстановле­нию, а какие нет.

Не способны к восстановлению микроорганизмы: Наеmophilus influenzae, Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Micrococcus radiodurans, вирусы, Cryptosporidium parvum, Staphylococcus aureus phage A994, Rotavirus SA-11, Poliovirus, MS2 phage.

Микроорганизмы, способные к восстановлению: Escherichia coli, Streptomyces spp., Saccharomyces spp., Aerobacter spp., Micrococcus spp., Erwinia spp., Proteus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Enterocolitica faecium, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Seratia marcescena, Vibrio cholerea, Yersinia enterocolitica.

В микробной клетке наиболее уязвимым компонентом является генетический материал, содержащийся в ДНК и РНК. И это не только из-за его уникальности, но также из-за структурных характеристик и больших размеров самой молекулы. Поэтому не удивительно, что все известные молекулярные процессы восстановления действуют на макромолекулярные нуклеокислоты, особенно на ДНК. Действие монохроматического УФ излучения на часть молекулы ДНК и ферментный процесс восстановления хорошо известен и описан в литературе (Ingraham, 1994). Процесс фотореактивации следует учитывать при проектировании систем УФ оббезараживания. Для предотвращения процесса фотореактивации УФ излучение должно разрушить большое количество молекул, включая ДНК.

Разрушения, причиненные УФ лампами низкого давления (с длиной волны 254 нм), относительно легко восстанавливаются активными ферментами, находящимися в микроорганизме. Однако не существует прецедентов повторения этого эффекта после воздействия полихроматических УФ ламп. Восстановительный процесс в других биомолекулах, кроме ДНК, не замечен.

Особенности УФ излучения низкой и высокой интенсивности

Микроорганизмы способны восстанавливаться, используя активные ферменты, такие как фотолиаза, эндонуклеаза, поли-мераза, лигаза (Dressler, 1986). Для запуска процесса фотореактивации необходимо излучение с длиной волны от 310 до 480 нм и время экспозиции от нескольких минут до нескольких часов. Все известные типы процессов молекулярного восстановления происходят в наиболее важной молекуле микроорганизма ДНК. Около 90% пиримидиновых поражений, причиненных УФ излучением с длиной волны 254 нм, могут быть восстановлены активными ферментами. С фотохимической точки зрения интенсивность УФ излучения или количество абсорбированной УФ энергии является менее важным фактором для достижения определенной степени дезинфекции, чем доза УФ излучения или общее количество абсорбированных фотонов. Например, УФ лампы низкого давления с низкой интенсивностью УФ излучения могут обеспечить одинаковую дозу УФ излучения с полихроматическими УФ лампами с высокой интенсивностью излучения, если время экспозиции увеличить на соответствующую величину. В этом случае степень и природа повреждения микроорганизма должны зависеть только от дозы УФ излучения, которая является производной его интенсивности и длительности экспозиции, как указано в законе взаимодействия (Bunsen-Roscoe):

Доза УФ излучения (мВс/см²) = интенсивность УФ (мВ/см²) х время (с).

Однако, поскольку эффективность УФ дезинфекции зависит не только от фотохимических реакций, но и от биологических процессов (восстановления), Harm (1980) установил, что указанный закон взаимодействия не может быть применен в этом случае. Интенсивность УФ излучения играет очень важную роль. Доказано, что наиболее сильный летальный эффект достигается при сочетании высокой интенсивности УФ излучения и короткой экспозиции. При равной дозе УФ излучения значительное снижение количества E.coli достигается при кратковременном использовании УФ излучения высокой интенсивности.

В 1999 г. после исследования фотохимических реакций многофотонных процессов, установлено, что единичная частица абсорбирует более одного фотона (Wayne, 1999). Такой вид абсорбции происходит только при значительной интенсивности УФ излучения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Практические исследования, выполненные такими авторитетными организациями, как DWGW ( Германия, Янссен, 1999), Onorm (Австрия, Янссен, 1999) и KIWA (Голландия, Круйтхоф, 1992) показали, что при одинаковой дозе УФ излучения, количество индикаторного микроорганизма Bacillus subtilis значительно уменьшалось при использовании УФ ламп среднего давления по сравнению с таковым при применении ртутных ламп низкого давления. Исследования показали, что, используя УФ лампы среднего давления, можно достичь такой же степени дезинфекции, как и при применении ламп низкого давления, но при этом доза УФ излучения может быть ниже на 35%. Это происходит за счет множества различных воздействий на микроорганизм УФ лампами с высокой интенсивностью излучения и широким спектром длины волн.

Linden (2001) описал результаты опытов по облучению Cryptosporidium parvum. Целью исследования было определение наиболее эффективной длины волны в бактерицидном спектре от 210 до 295 нм с использованием УФ ламп среднего давления. Наиболее высокий бактерицидный эффект достигнут при длине волны 271 нм. Эффективность длины волны 271 нм была на 15% больше, чем длины волны 254 нм. Даже при длине волны 263 нм отмечено эффективное действие на этот микроорганизм.

Образование связанного органического углерода

В настоящее время УФ лампы среднего давления широко используются во всех процессах очистки воды. Представители голландской фирмы KIWA (Круйтхоф, 1992) заявляют, что УФ излучение не изменяет концентрацию связанного органического углерода и не приводит к увеличению мутагенности, в то же время при вторичном хлорировании отмечают небольшое увеличение концентрации связанного органического углерода и значительное повышение мутагенности воды.

Различия процесса фотореактивации при использовании УФ ламп низкого и среднего давления третьего поколения (мультиволновых)

Zimmer в 1992 г. показал, что E.coli имеет возможность к фотореактивации после воздействия излучения УФ ламп низкого давления. В то же время не было отмечено этого процесса после применения УФ излучения ламп среднего давления. Oguma (2001) исследовал фотореактивацию E.coli и Cryptosporidium parvum, используя лампы низкого давления и мультиволновые. Пиримидиновые димеры, разрушенные УФ лампами низкого давления, постоянно репарировали, этот процесс не был отмечен при использовании УФ ламп среднего давления третьего поколения.

■ ВЫВОДЫ

1. Новое поколение УФ ламп среднего давления объединяет в себе такие важные свойства, как широкий спектр электромагнитных волн и высокая интенсивность УФ излучения. Такое сочетание является причиной многофотонного фотохимического повреждения внутри микробной клетки. В дополнение к этому воздействие волн длиной меньше и больше 300 нм и волн, расположенных в видимом спектре, является эффективным при уничтожении микроорганизмов , особенно больших размеров.
2. Некоторые микроорганизмы могут восстанавливать УФ поврежденную ДНК с помощью ферментов даже в отсутствие солнечного света. Восстановительные процессы в других поврежденных УФ излучением биомолекулах, кроме ДНК, не обнаружены.
3. Закон взаимодействия Бансена-Роское не может быть применен при расчете степени уничтожения микроорганизмов, так как биологические процессы играют очень важную роль.
4. Широкий спектр электромагнитных волн, излучаемый мультиволновыми УФ лампами среднего давления, более эффективен в процессе уничтожения крупных и УФ стойких микроорганизмов.
5. Шансы для начала процесса фотореактивации после муль-тиволнового воздействия незначительны. Для уничтожения таких микроорганизмов, как Cryptospo-ridium parvum и Bacillus subtilis наиболее эффективно воздействие волн длиной 270 нм.
6. Установлены различия в процессе фотореактивации после воздействия УФ ламп низкого и среднего давления. Повреждение, причиненное УФ лампами низкого давления, легко восстанавливается, восстановление после облучения УФ лампами среднего давления не наблюдали.